FDA注冊號：
3010704506
細菌脂肪酸的提取與分析
發(fā)布時間：
2018-09-10
概要：
試劑: 0.3%甲醛、6 mo1/1 HC1-CH3OH溶液、三氯甲烷方法: GC- -MS 聯(lián)用分析測定，步驟如”下:
(1)菌體的培養(yǎng)與收集
I組實驗菌株用YPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中添加一定量的抗凍保護劑，接種后放入30°C、150 r/ min的搖床中培養(yǎng)24 h。細胞振蕩培養(yǎng)至生長對數(shù)中期，移取適量細胞懸浮液至-30°C冰箱冷凍7d， 取出30°C 下解凍5-10min,用0.3%甲醛滅活后， 4000r / min下離心5 min, 棄去上清液，用蒸餾水洗滌，離心收集細胞，-18C冷凍， 冷凍真空干燥制得千細胞后備用。
空白樣用0.3%甲醛滅活后， 4000 r/ min下離心5 min,棄去上清液，用蒸餾水洗滌，離心收集細胞，-18C冷凍 24h，冷凍真空千燥制得千細胞后備用。
II組實驗菌株用于面包冷凍面團的制備，添加抗凍保護劑，于-20C冷凍30d后取出解凍，取20g解凍后的面團，分散于180ml 無菌水中，震蕩30min, 靜置15min，離心并取上清液。用0.3%甲醛滅活后， 4000r / min下離心15 min, 棄去上清液，用蒸餾水洗滌，離心收集細胞，-18C冷凍，冷凍真空干燥制得干細胞后備用。空白樣則不添加抗凍保護劑，其余處理方法-樣。
(2) 脂肪酸的甲基化與提取
取50 mg凍千細胞加入6 mol/1 HC1-CH3OH溶液2 m1，置100°C的條件下鹽酸水解甲基化3 h，溶液呈現(xiàn)棕褐色(或黑褐色)，取出，置室溫下冷卻。加入正己烷1.5m1振蕩。經4000 r / min離心10min， 收集上清液再加入正已烷1.5m1 .抽提一次，合并兩次.上清液，加入蒸餾水3ml，經4000r/ min離心10 min,收集上清液于離心管中。用流動N2吹千，加入10μ1三氯甲烷制備脂肪酸酯化液。
(3)薄層層析
用玻璃毛細管取脂肪酸酯化液點在硅膠G-TLC薄層板上，以正已烷+無水乙醚(1+1)為展層系統(tǒng)，待層析液至硅膠板上緣后立即取出薄層板，風干。在UV254燈下檢查制備的脂肪酸純度與相對濃度。將脂肪酸甲酯帶做好標記，輕輕刮下，用二乙醚抽提兩次，經N吹千后加入0. 5ml無水甲醇振蕩溶解，然后進行GC一MS分析。
(4)GC--MS操作條件
程序升溫:初溫130°C， 保持1 min; 終溫280°C，維持min,升溫速度7.6°C / min。 檢測器溫度250°C;載氣(He)流速30ml / min; 分流比50: 1;流速(He)49. 9ml / min;進樣量1μl。 (2)中質譜條280°C，質量掃描范圍35-500。
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